Konstruktion und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente zur experimentellen Therapie der Hodgkinschen Krankheit

Konstruktion und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente zur experimentellen Therapie der Hodgkinschen Krankheit

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Inhaltsangabe:Einleitung: Ein CD30+-Hodgkin-Lymphom ist eine maligne Erkrankung, fA¼r die eine AntikAprpertherapie sehr vielversprechend ist. Ziel der Arbeit war es, fA¼r einen solchen Therapieansatz aus den DNA-Sequenzen herkApmmlicher rekombinanter bispezifischer AntikAprper-Fragmente ein im Bezug auf Wirksamkeit und StabilitAct optimiertes Format herzustellen und zu charakterisieren. Zur Optimierung der Expression sollten zwei bispezifische Diabodies anti-CD16/CD30 bakteriell exprimiert und aufgereinigt werden. Die verbesserten Expressionseigenschaften einer Variante des bsDb gegen CD30 (mCD30) sollte durch den Vergleich mit dem Wildtyp bsDb bestActigt werden. Aus den scFv gegen CD30 und CD16 sollten anschlieAŸend zwei bispezifische und tetravalente Tandemdiabodies mit unterschiedlichen AminosAcure-Linkern generiert werden. Die Konstrukte der TandDb sollten ebenfalls exprimiert und aufgereinigt werden. Die AntikAprper-Fragmente mit der SpezifitAct anti-CD30/CD16 dirigiert NK-Zellen an H-RS-Zellen, initiieren die ADCC der NK-Zellen und fA¼hrt zu einer spezifischen Lyse der H-RS-Zellen. Ein weiteres Ziel war es, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten rekombinanten AntikAprper-Fragmente zu charakterisieren und im Rahmen eines in vitro-CytotoxizitActstests gegen eine etablierte Hodgkin Zelllinie die therapeutischen Wirksamkeit zu A¼berprA¼fen. Auf diese Weise sollten neuartige Formen rekombinanter AntikAprper-Fragmente generiert und getestet werden, um die Grundlage fA¼r eine effektive AntikAprper-basierte Therapie fA¼r die Hodgkinsche Krankheit zu etablieren. Inhaltsverzeichnis:Inhaltsverzeichnis: 1.Einleitung1 1.1Die Hodgkinsche Krankheit1 1.2Molekularbiologische Eigenschaften von Hodgkin-und Reed-Sternberg-Zellen3 1.3Das CD30-Antigen5 1.4Cytotoxische Mechanismen von natA¼rlichen Killerzellen7 1.5Struktur und Funktion von Immunglobulinen und bispezifischen AntikAprper-Fragmenten (Diabodies/Tandemdiabodies)9 2.Aufgabenstellung14 3.Zusammenfassung15 4.Material16 4.1Laborbedarf16 4.2GerActe16 4.3Chemikalien17 4.4Puffer, Medien und andere LApsungen18 4.5Enzyme21 4.6AntikAprper21 4.7BakterienstAcmme22 4.8Zelllinien22 4.9Oligonucleotide23 4.10Vektoren24 5.Methoden26 5.1Molekularbiologische Methoden26 5.1.1Polymerase-Kettenreaktion (PCR)26 5.1.2Splice overlap extension-PCR26 5.1.3Restriktionsspaltung von DNA27 5.1.4Agaroseelektrophorese von DNA-Fragmenten27 5.1.5Dephosphorylierung von 5a€™-Enden der linearisierten Vektoren28 5.1.6Ligation von DNA-Fragmenten28 5.1.7Transformation von kompetenten Bakterien28 5.1.8Isolierung von Plasmid-DNA aus E. Coli29 5.1.9Konservierung der Bakterienklone29 5.2Proteinbiochemische Methoden29 5.2.1PrAcparation von periplasmatischen Extrakten29 5.2.2GroAŸexpression von AntikAprper-Fragmenten in E. Coli30 5.2.3Isolierung von AntikAprper-Fragmenten aus dem periplasmatischen Raum30 5.2.4Dialysemembranen31 5.2.5AmmoniumsulfatprAczipitation der AntikAprper-Fragmente31 5.2.6Immobilisierte Metall-Chelat-Chomatographie (IMAC)31 5.2.7SDS-PAGE32 5.2.8Westernblot-Analyse32 5.2.9AœberprA¼fung des Klonierungserfolgs33 5.2.10Ionenaustauschchromatographie33 5.2.11Bestimmung der Protein-Konzentration34 5.2.12Bestimmung des AntikAprper-Formats35 5.3Zellkultur-Methoden35 5.3.1Kultivierung eukaryontischer Zellen35 5.3.2PBMC-/Granulozyten-PrAcparation36 5.3.3BsAk-vermittelter in vitro-CytotoxizitActstest37 5.4Durchflusscytometrie38 5.4.1Bindungstest von periplasmatischen Extrakten und aufgereinigten AntikAprper-Fragmenten39 5.4.2Titration der bsAk auf CD16+- bzw. CD30+-Zellen39 5.4.3Cell-surface-retention-Test40 5.4.4Messung der in vitro-StabilitAct der AntikAprper-Fragmente41 6.Ergebnisse42 6.1Klonierung von AntikAprper-Fragmenten42 6.1.1Klonierung eines Konstrukts fA¼r einen bispezifischen anti mCD30/C16-TandDbscFv10-SL-scFv1042 6.1.2Klonierung eines Konstrukts fA¼r einen bispezifischen anti-mCD30/CD16-TandDb scFv6-SL-scFv644 6.2Test des TandDb-Konstrukts zur Auswahl des Klons fA¼r die Expression in der GroAŸkultur46 6.3Aufreinigung der in GroAŸkulturen exprimierten AntikAprper-Fagmente47 6.4Bestimmung der Proteinkonzentration51 6.5Bestimmung des AntikAprper-Formats52 6.6AœberprA¼fung der Reinheit der AntikAprper-Fragmente54 6.7Charakterisierung der isolierten PBMC/Granulozyten54 6.8Bindungstest und Titration der AntikAprper-Fragmente auf diversen Zelllinien55 6.9Cell-surface-retention-Test58 6.10AntikAprper-vermittelter in vitro-CytotoxizitActstest mittels PBMC gegen die Hodgkinzelllinie L540CY60 6.11Messung der in vitro-StabilitAct der bsAk62 7.Diskussion64 7.1Mutagenese der anti-CD30-scFv-DomAcne64 7.2Auswahl der Peptide fA¼r die kovalente Verbindung von Fv-DomAcnen65 7.3GroAŸexpression und Aufreinigung der AntikAprper-Fragmente in E. Coli66 7.4Charakterisierung der rekombinanten AntikAprper-Fragmente65 7.5Vermittlung einer NK-Zell-induzierten Tumorzelllyse durch anti-mCD30/CD16-bsDb/scDb in vitro68 7.6Vergleich der anti-mCD30/CD16-bsDb/scDb70 8.Ausblick71 9.Literaturverzeichnis72 10.Anhang79 10.1Klonierungsschema fA¼r die Herstellung von anti-CDm30/CD16-TandDb79 10.2Vektorkarten und Sequenzen85 AbkA¼rzungsverzeichnis95Abb 6.2. zeigt das Elutionsprofil der IMAC am Beispiel des bsDb wt anti-CD30/ CD16. ist die Absorption im ... 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 66 45 36 29 24 20 66 18 M 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 45 36 29 24 20 scFv10 (30-16) anbsp;...


Title:Konstruktion und Charakterisierung rekombinanter bispezifischer Antikörper-Fragmente zur experimentellen Therapie der Hodgkinschen Krankheit
Author: Norman Woller
Publisher:diplom.de - 2002-10-29
ISBN-13:

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